乙肝病毒及其蛋白成分影响肝星状细胞增殖和细胞外基质表达
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时间:2016.3.2
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乙肝病毒(HBV)及其蛋白成分对肝星状细胞增殖的影响,及对肝星状细胞的细胞外基质合成和降解的影响,可能与HBV致肝纤维化的机制相关。
我们从HBV转染的HepG2.2.15(人类肝癌细胞株)培养上清液中获得HBV,以HepG2(人类肝癌细胞株)细胞培养上清液为对照。重组乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白以普通无血清培养基为对照。将含有不同浓度HBV的HepG2.2.15细胞上清液、一定浓度的HBsAg或HBeAg,分别加入LX-2(人类肝星状细胞株)细胞培养基中,持续培养48小时。
用噻唑蓝分析法(MTT)检测HBV、HBsAg及HBeAg对LX-2细胞增殖的影响,并依据MTT检测结果选取高浓度(存活率90%以上)和低浓度(促增殖作用达到平台期)HBV的细胞培养上清液,应用流式细胞仪PI染色及BrdU掺入法,观察HBV、HBsAg及HBeAg对LX-2细胞的细胞周期和增殖的影响。结果显示,不同浓度的HBV、HBsAg及HBeAg均有促进LX-2细胞增殖的作用。
在高、低两种浓度的HBV、HBsAg及HBeAg分别刺激LX-2细胞48小时之后,应用实时荧光定量PCR方法检测LX-2细胞培养上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)及基质金属蛋白酶(MMP-1)的mRNA表达水平,同时应用酶联免疫吸附测定法检测上述指标的蛋白表达水平。
结果显示,高浓度(1.2×105拷贝/ml)HBV作用于LX-2细胞48小时后,可显著促进LX-2细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和MMP-1的mRNA表达,还可以显著升高TGF-β1、Ⅰ型胶原和TIMP-1的蛋白表达水平(P<0.05)。低浓度(3.9×103拷贝/ml)HBV对TIMP-1的mRNA表达及TIMP-1的蛋白表达作用不明显,余与高浓度HBV作用相似。
高浓度HBsAg可以使TGF-β1和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平显著提高(P<0.05),低浓度HBsAg仅可以提高TGF-β1的mRNA表达水平。HBsAg对其他指标的mRNA水平和所有指标的蛋白表达水平均无明显影响。
高浓度HBeAg可以显著升高LX-2细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和MMP-1的mRNA表达水平,还可以促进TGF-β1、Ⅰ型胶原和TIMP-1的蛋白表达,低浓度HBeAg可以显著升高TGF-β1和TIMP-1的mRNA表达水平及TGF-β1和Ⅰ型胶原的蛋白表达水平(P<0.05)。
研究结果提示,在体外培养条件下,HBV及其蛋白成分均可促进肝星状细胞增殖,一定浓度HBV和HBeAg可以使肝星状细胞的细胞外基质(ECM)合成增加,相对较高浓度HBV和HBeAg的上述作用更为明显,而HBsAg对肝星状细胞ECM合成和降解的影响较小。HBV和HBeAg对ECM的降解作用尚不明确,HBV及其蛋白成分影响ECM合成,可能是通过TGF-β1发挥作用。
我们从HBV转染的HepG2.2.15(人类肝癌细胞株)培养上清液中获得HBV,以HepG2(人类肝癌细胞株)细胞培养上清液为对照。重组乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白以普通无血清培养基为对照。将含有不同浓度HBV的HepG2.2.15细胞上清液、一定浓度的HBsAg或HBeAg,分别加入LX-2(人类肝星状细胞株)细胞培养基中,持续培养48小时。
用噻唑蓝分析法(MTT)检测HBV、HBsAg及HBeAg对LX-2细胞增殖的影响,并依据MTT检测结果选取高浓度(存活率90%以上)和低浓度(促增殖作用达到平台期)HBV的细胞培养上清液,应用流式细胞仪PI染色及BrdU掺入法,观察HBV、HBsAg及HBeAg对LX-2细胞的细胞周期和增殖的影响。结果显示,不同浓度的HBV、HBsAg及HBeAg均有促进LX-2细胞增殖的作用。
在高、低两种浓度的HBV、HBsAg及HBeAg分别刺激LX-2细胞48小时之后,应用实时荧光定量PCR方法检测LX-2细胞培养上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)及基质金属蛋白酶(MMP-1)的mRNA表达水平,同时应用酶联免疫吸附测定法检测上述指标的蛋白表达水平。
结果显示,高浓度(1.2×105拷贝/ml)HBV作用于LX-2细胞48小时后,可显著促进LX-2细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和MMP-1的mRNA表达,还可以显著升高TGF-β1、Ⅰ型胶原和TIMP-1的蛋白表达水平(P<0.05)。低浓度(3.9×103拷贝/ml)HBV对TIMP-1的mRNA表达及TIMP-1的蛋白表达作用不明显,余与高浓度HBV作用相似。
高浓度HBsAg可以使TGF-β1和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平显著提高(P<0.05),低浓度HBsAg仅可以提高TGF-β1的mRNA表达水平。HBsAg对其他指标的mRNA水平和所有指标的蛋白表达水平均无明显影响。
高浓度HBeAg可以显著升高LX-2细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和MMP-1的mRNA表达水平,还可以促进TGF-β1、Ⅰ型胶原和TIMP-1的蛋白表达,低浓度HBeAg可以显著升高TGF-β1和TIMP-1的mRNA表达水平及TGF-β1和Ⅰ型胶原的蛋白表达水平(P<0.05)。
研究结果提示,在体外培养条件下,HBV及其蛋白成分均可促进肝星状细胞增殖,一定浓度HBV和HBeAg可以使肝星状细胞的细胞外基质(ECM)合成增加,相对较高浓度HBV和HBeAg的上述作用更为明显,而HBsAg对肝星状细胞ECM合成和降解的影响较小。HBV和HBeAg对ECM的降解作用尚不明确,HBV及其蛋白成分影响ECM合成,可能是通过TGF-β1发挥作用。
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