乙肝病毒变异与临床

        病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一，乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中通过RNA中间体，在DNA-P和逆转录酶活性是有效而迅速的，但DNA-P缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人表现为不同的基因型，最近已确定HBV有7个基因型(A-G)，并与地理因素相关。在美国和欧洲主要是基因型A和D。B和C主要在中国和东南亚。已发现基因型与临床预后和治疗反应相关。基因型在漫长的岁月中突变累积形成的基因组结构，在这里的变异是指基因型以外的变异，包括HBV的前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生突变、插入或缺失、移框突变等，通常把病毒株分为野毒株(wild strain)和变异株(variation strain)，一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义。现分述于下。
　　

        一、前C/C基因变异
　　前C1896位(A83)的变异：是HBV中最常见的变异。1989年英国学者Carman等首次报导了HBV前C1896位的突变。野毒株1896位是G，变异为A，A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG)，使前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成，但它并不影响病毒复制，因此临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)，而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。进一步研究该变异的分子基础发现前C区含一个发夹形纤襻结构，在1858位与1896位间，将不稳定的T-G对(与基因型有关)变异为T-A对，使前基因组RNA结构更稳定，更有利于病毒复制，并可导致优势株。
　　

       在分析HBV变异的临床意义时，可从慢性HBV感染者的动态血清学、临床表现与前C区变异关系时发现慢性感染HBeAg(+)期，病毒高滴度，但临床常无加重。随着感染持续，出现了HBeAg(-)前C变异株，并逐渐累积，此时血清学仍可为HBeAg(+)，但血清中已可同时检测野毒株和变异株，其中野毒株逐步被清除，临床上常伴肝炎发作；随着前C1896变异株选择优势的发展，血清学可转换为HBeAg(+)，但在血清中仍可检测到HBeAg分泌的野毒株，在临床上既可表现为病情加重，也可表现为病情缓解；若选择的结果进入均一eAg不表达的变异株，则ALT可轻微升高，但病情可无明显加重。
　　

       总之，在慢性HBV感染过程中，野毒株和eAg(-)变异株的并存，常与疾病的加重有关。相反，在病情稳定的患者中，仅发现单一的野毒株或HBeAg(-)的变异株。有关eAg消失后前C区变异与病情活动，国内外已有不少相关报导。但对此也有不同观点，认为前C区变异是普遍现象，与疾病严重似无明显相关。这可能涉及变异分析技术因素，包括方法敏感性、定量分析、动态观察或定量分析等。
　　

       前C1896位(A83)和1899位(A86)的双变异：在HBV前C1896位(A83)变异常伴随1899位(A86)变异。即在1899位的G→A变异。这样就连成一个短序列为TAGGA。已发现该变异可能增强核糖体的结合，使核壳蛋白可活跃转译，认为1899位变异是1896变异代修性措施。这种双变异具有优势选择，使HBV有较高复制水平和传染性。
　　

        二、C基因的变异
　　

        近几年来几项研究表明在病毒清除期，基因组较保守的部位发生了选择性变异，以C区中部的变异或缺失，特别是错义变异至少可涉及4个B细胞靶位、2个细胞毒T细胞(CTL)表位和3个Th细胞表位。
　　

        C区的变异与临床相关性研究：在codon 130的变异是T、B细胞共有的表位。A Okumara分析了变异株(Core 130 Thr)和野毒株(Core 130 Pro)在慢乙肝中与肝损害关系，结果表明在5例慢乙肝，病情加重，ALT升高时C130(Pro-Thr)变异株占优势，而在ALT高峰下降后野毒株为优势，而在3例慢性携带者野毒株(C 130 Pro)始终占优势。作者认为HBVC区Codon 130是最重要的免疫原性区，Thr/Pho比值的增高是免疫筛选的表位和B细胞表位和HBc/e抗体结合决定簇、CD4+细胞Th细胞和B细胞识别区段，可部分逃避免疫反应，使肝脏损害持续存在，常与前C区终止变异同时发生或在前C变异后再出现，与进展性抗e(+)慢性肝病相关。?隋礼丽、骆抗先等研究了HBV/C基因变异对宿主细胞HLA表达的影响，结果发现：V60、G87和L97变异株与野毒株相比可增强HLA的表达，从而可解释CTL对宿主细胞杀伤性增强，是病毒变异和疾病进展相关原因之一。
　　

        三、X基因的变异
　　

        X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响到病毒的转录和复制。研究较多的是核心蛋白的启动子(CP)。
　　

        慢性乙型肝炎BCP区的变异：BCP的变异是多点和复合的，主要是1762(A-F)、1764(G-A)的双变异，BCP区是富含AT区域，具有肝脏富含因子的独立结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C的RNA转录，最终使HBeAg表达减少，平均降低70%。BCP的变异还可增强前基因组RNA转录增强(2～3倍)，病毒包装有很大增强(10×)。
　　

        最近对3P启动子CCTTA附近的缺失变异可影响24KbPre-S1mRNA和21KbSmRNA的转录表达，与外科肝移植后发生胆汁性淤积有关。Ha?Lee则发现在Pre-sp转录起始编码的缺失。
　　

        目前认为X基因区BCP、SP或PreSP的变异改变了HBV基因表达的平衡，与HBV持续感染相关。
　　

        暴发型肝炎患者CP1638位(T-C)、1673位(C-T)、1727位(A-T)、1730位(C-G)变异：出现较多。Sato等发现在暴发型肝炎或急性自限性乙肝中，CP和前C区联合突变或单独出现，尤其是A基因型优势株地区所发生暴发型肝炎有意义。
　　

        四、前S/S基因变异
　　

        HBV包膜蛋白是宿主体液和细胞免疫反应的靶位点。前S/S变异可使HB疫苗或HB免疫球蛋白保护无效。有些部位的变异还涉及血清学标志的改变而影响诊断的灵敏度。
　　

        乙肝疫苗免疫后仍出现HBsAg(+)的小儿中，发现了HBsAg"a"决定簇的变异株，可有一点或多点变异，其中最重要的突变是145位的甘氨酸替代了精氨酸，这是由于HBV逃避宿主的免疫压力选择性结果，有时这种变异株在母体内为少数，而在疫苗免疫后的小儿却成为优势株。在肝衰竭进行肝移植后应用单克隆抗体或高效价HBeAg治疗后也可出现HBeAg变异，这些突变大多数发生在"a"决定簇145位的甘氨酸-精氨酸。
　　

        还有报导则在HBeAg(-)、HBV DNA(+)患者中发现124位半胱氨酸缺失，导致HBeAg的分泌障碍，而使免疫学标志出现HBeAg(-)。
　　

        五、P基因变异
　　

        P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠。P基因主要编码DNA-P，该基因共分成5个区(A、B、C、D和E)。这些区域是较保守的，参与核苷酸或模板结合，并且具有催化活性。近年来，在用核苷类药物治疗患者中，出现了P基因突变的报道，体内外试验表明这些突变株与药物耐药相关。
　　

       拉米呋啶引起YMDD突变：拉米呋啶(Lamivudine,LAM)是当前HBV治疗广泛应用的核苷类似物，它能显著降低HBV DNA水平(4～5logs)，并可使ALT正常化和肝组织学改善。若长期治疗，则在DNA-P的保守区(C)的YMDD基序发生变异。目前认为变异的耐药机制是由AA552的蛋氨酸被颉氨酸或异亮氨酸替代(即M552I/U)，使此链缩短，结合点变大，不再适合拉米呋啶结合而导致耐药。
LAM引起YMDD(C)和B区的联合变异：除YMDD为主要变异外，常合并上游(B)的L528M的变异。根据不同的变异形式可分成三组。

　　LAM治疗和肝炎突发：在美国和亚洲二个LAM临床试验报告了HBV DNA下降了2～3个logs。二年的HBeAg阴转率为27%，YMDD的发生率分别为32%和14%，但随着治疗的延长，在亚洲40%发生了LAM的耐药变异。LAM相关的ALT突发见于服药期间变异株患者，有部分患者停药后也发生了复发。
　　

        台湾Liao对55例病人经LAM治疗104周，其中32例(60%)检测出YMDD株，变异率为58．2%。32例变异者中有30例出现ALT的升高(93.7%)。其中13例(40.6%)出现肝炎急性发作。在发作前HBV DNA水平升高至顶点，在1～4周后ALT升高达顶峰(247～2010U/L)，发作后8例出现eAg阴转，3例出现失代偿，但在血清eAg转阴后，病情恢复。作者认为YMDD变异株出现急性发作或急剧变化可导致HBV清除，其病程和临床病理特征与HBV野生株慢性感染相似。
　　

        对LAM耐药致肝炎急性发作的理解，认为应从HBV感染的免疫致病机理包括宿主的免疫因素和病毒的复制。慢性HBV感染者常显示抗病毒T细胞免疫的低反应性。在发作前可先观察到一个高的病毒滴度，接之可激活抗HBV细胞免疫反应，此免疫反应直接针对感染的肝细胞，导致肝细胞坏死和临床肝炎表现。当体内耐药变异株增多，复制增加时，也可激发机体免疫反应引起临床肝炎的突发。若强有力的免疫反应能控制病毒的复制，则结局是病毒清除(eAg转阴，HBV DNA消失)和疾病恢复。如果免疫反应不足以消灭病毒，则肝功能可持续异常。由于LAM是一个直接抗病毒的药物，机体内在的免疫反应十分重要，治疗前ALT增加5～10倍治疗结局良好。因此LAM长期治疗后YMDD变异株发展后，内在的细胞免疫反应也决定了是否发生肝炎发作及其肝损害的程度。
　　

        YMDD耐药变异的防治：随着用药时间的延长，核苷类药物易引起病毒变异，导致耐药。为了减少耐药性的出现，一方面可以联合用药。从理论上讲，IFN和核苷类药物在不同的靶位点联合应用，可减少耐药株的出现。Schalm等报道称230例患者随机分成3组(INF、LAM、LAM-IFN)，结果52周时的三组HBeAg阴转率分别为19%，18%和39%。联合治疗的疗效更明显。但对此也有相反意见，在美国、加拿大、欧洲进行的IFN和LAM联合治疗疗效也不佳。有人报道，对LAM耐药株M5522变异可用LAM-FAM序贯治疗可抑制病毒复制，但不同意见者认为FAM在P区也可出现L528M变异，该药所出现的P区其他突变V521L，P525L、W501E等，亦可引起肝炎突发。阿德福韦是一个广谱的抗病毒药物。在HIV治疗过程中未发现有耐药变异。Xiong等重组含有M512I、M512V、L528M、M552V变异的HBV株，对LAM耐药的阻滞常数较野毒株增加了8.0、19.6和25.2倍，但所有变异株对阿德福韦均敏感，且对联合变异也有效。
　　

       对于YMDD变异导致急性发作和病情急剧变化是否继续应用LAM，一般认为LAM对野毒株继续有效，应继续用药，但在LAM变异株产生病情急剧变化，特别SB＞50μmol/L时应予停药。最近，omeya T报道了一例LAM耐药引起急剧变化时(SB 4.9mg/L，ALT 1230IU/L，HBV DNA 68Meq/ml)继续应用LAM同时加用IFN-α使变异株清除，LAM使变异株清除，从而使病情缓解。
　　

       结语：HBV变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，在HBV前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生变异。有些变异并无生物学意义，但有些变异经体内外试验证实是与临床相关的。在长期应用核苷类药物中，HBV的变异也会不断发生，需动态监测变异的发生、发展与临床关系。在治疗策略上，可针对HBV复制过程的靶位点，开发新的药物，并设计联合治疗。